PCR扩增产物的克隆
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PCR扩增产物的克隆

标签: PCR 扩增 克隆

PCR扩增产物的克隆可以:(1)获得目的DNA片段;(2)用于原核表达的研究;(3)广泛应用于分子生物学相关研究。

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实验方法原理

平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头;PCR产物纯化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性)。

如果要求不高,PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,这两种酶有5’→3’校对能力,扩增出来的PCR产物已经是平头,可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下,即使使用很高单位的连接酶,或在反应体系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。

通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。

这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高,在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率。

对于较短PCR产物,用PUS19的HincⅡ位点进行克隆,以X-gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法克隆PCR产物。

 

实验材料

模板DNA

试剂、试剂盒

SauI Klenow片段 T4连接酶

仪器、耗材

移液器 移液器吸头 PCR小管 DNA扩增仪 电泳槽 电泳仪 台式高速离心机


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